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PROJETO DE PESQUISA PARA CONCURSO DE SELEÇÃO DE UTILIZAÇÃO DO DERIVADO SULFATADO DO
POLISSACARÍDEO DE Anacardium occidentale
NA REABILITAÇÃO DE LESÕES CUTÂNEAS
Candidata: Margareth Mayer de Castro Souza Orientadora: Profa Dra Nereide Stela Santos Magalhães 1.0 INTRODUÇÃO
1.1 BIOMATERIAIS
1.2 POLISSACARÍDEOS
1.3 LIPOSSOMAS
1.4 CICATRIZAÇÃO
2.0 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
3.0 RELEVÂNCIA DO TRABALHO
4.0 LOCAL DE EXECUÇÃO E EQUIPE DE COLABORADORES
5.0 MATERIAIS E MÉTODOS
5.1 EXTRAÇÃO, SULFATAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO
POLISSACARÍDEO DE A. occidentale
5.2 FORMULAÇÃO DE LIPOSSOMAS
5.3 FORMULAÇÃO DE GÉIS E EMULSÕES
5.3.1 Preparação de gel hidroalcoólico
5.3.2 Preparação de emulsões
5.4 INCORPORAÇÃO DOS LIPOSSOMAS NO VEÍCULO
5.5 CARACTERIZAÇÃO DOS LIPOSSOMAS CONTENDO O
POLISSACARÍDEO DE A. occidentale
5.5.1 Estudo de Estabilidade das Formulações
5.5.2 Taxa de encapsulação do P JU nos lipossomas
5.6 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CICATRIZANTE DAS
FORMULAÇÕES CONTENDO POLISSACARÍDEO DE A. occidentale
5.6.1 Animais
5.6.2 Protocolo experimental
5.6.2.1 Grupos experimentais
5.6.2.2 Procedimento experimental
5.6.2.3 Avaliação pós-operatória
5.6.2.3.1 Avaliações clínicas
5.6.2.3.2 Avaliação macroscópica da lesão
5.6.2.3.3 Avaliação microbiológica
5.6.2.3.4 Avaliação da contração da ferida
5.6.2.3.5 Avaliação histopatológica
5.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA
6.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
7.0 CRONOGRAMA
8.0 DURAÇÃO DO PROJETO
9.0 APOIO FINANCEIRO

1.0 INTRODUÇÃO
1.5 BIOMATERIAIS
Um biomaterial pode ser definido como um "material interativo" capaz de estabelecer uma afinidade com o tecido vizinho sem induzir uma resposta adversa dohospedeiro (Palapura & Kohn, 1992; Zhao et al., 1990).
A cartilagem, considerada um biomaterial, tem, por mais de duas décadas, sido investigada na aceleração de processos cicatriciais. Estudos realizados por Prudden et
al. (1970) demonstraram a eficácia de extratos de cartilagem em processos de
cicatrização, em tratamentos sistêmicos e tópicos. Atribui-se este efeito aos seguintes
fatores: a) Ausência de alergenicidade da cartilagem, produzindo efeitos idênticos
independente da fonte da qual é obtida; b) Aumento de três componentes histológicos:
reticulócitos, fibroblastos e colágeno; e, c) Natureza do princípio ativo - glicosaminas e
N-acetilglicosaminas ácidas.
Outros biomateriais, como a quitina e a quitosana, que são polímeros de N- acetilglicosamina, têm sido utilizados com excelentes resultados, aumentando avelocidade de cicatrização em camundongos (Carvalho, 2000). A quitina aumenta aforça de tensão nos pontos de sutura em ratos (Yano et al., 1985) e coelhos (Nakajima etal., 1985), sem efeitos colaterais adversos (Nakajima et al., 1986; Sapelli et al., 1986).
Estes polissacarídeos também favorecem a cicatrização promovendo uma adequadaproporção de transmissão de vapor d'água, a qual, junto com a capacidade absortiva deágua do revestimento, controla o balanço hídrico (Wu et al., 1995). Além do mais,quitina e quitosana obtidas a partir de culturas de Aspergillus oryzae, Mucor macedo ePhycomyces blaskeleeanus aumentam a proliferação de fibroblastos F 1000 humanos, invitro (Chung et al., 1994, 1998).
Os polissacarídeos podem ser utilizados como biomateriais, apresentando muitas vantagens como a livre administração, simplicidade de operação, evitar o uso deantibióticos para animais de produção e companhia e, em, especial, o barateamento doscustos de produtos (Shigemasa & Minami, 1995).
Os polissacarídeos são, atualmente, considerados moléculas farmacologicamente ativas, apresentando atividade anti-viral (Yamada et al., 1997), anti-coagulante(Mueller & Scheidt, 1994; Nishino et al., 1994; Tavares, 1994; Germano, 1996; Stuelp,1997) e antitumoral (Whistler et al., 1976; Bohn & BeMiller, 1995; Carneiro-Leão,1998).
Quanto aos seus mecanismos de ação in vivo e in vitro, polissacarídeos de diferentes origens (fungos, vegetais, e líquens) e diversas estruturas químicas, têm sidoinvestigados, como amplamente revisado por Whistler et al. (1976), Bohn & BeMiller(1995), Wasser & Weis (1999) e Kidd (2000).
O mecanismo de ação in vivo dos polissacarídeos, ainda não completamente esclarecido, envolve essencialmente a imunomodulação, permitindo a classificaçãodestes agentes como modificadores da resposta biológica (Hersh & Taylor, 1991; Han etal., 1999). A imunomodulação ocorre por meio da potencialização da atividade doslinfócitos T e dos macrófagos citotóxicos (Ng, 1998; Pedrinaci et al., 1999), o que estáintimamente relacionado com um aumento da produção de citocinas, especialmente IL-1, IL-2, Fator de Necrose Tumoral (TNF) e Interferon-γ (IFN-γ) (Arinaga et al., 1992;Liu et al., 1998, 1999).
A atividade imunomoduladora dos polissacarídeos também tem sido observada em outros modelos, a exemplo do aumento da resistência e sobrevida frente à sepsis polimicrobiana (Williams et al., 1999) e por Pseudomonas aeruginosa (Bryan et al.,1999), como componente de vacinas (Ho et al., 2000), na adesão de H. pylori a célulasgástricas (Shibata et al., 1999) e no tratamento de infecções experimentais peloSchistosoma mansoni (Carneiro-Leão et al., 1999; Procópio et al., 2000a e b).
Processos de derivatização química de polissacarídeos, como sulfonilação, fosforilação, carboximetilação, e sulfatação têem sido utilizados para potencializar aatividade biológica dessas moléculas, o que tem sido justificado por uma conformaçãomais ativa, ligação eletrostática ao receptor e/ou ligante, entre outros (Bohn & BeMiller,1995).
A presença de grupamentos sulfato tem sido relacionada ao efeito anti- coagulante (Nishino et al., 1991; Nishino & Nagumo, 1992), e a outras atividadesbiológicas, como a inibição da infectividade pelo vírus HIV-1 (Kaneko et al., 1990;Hasslin et al., 2001) e bactérias (Chlamidia trachomatis, Zaretzky et al., 1995). Quantoà atividade anti-tumoral, Carneiro-Leão (1998) e Carneiro-Leão et al. (1997) relataramo aumento do efeito da α-glucana do líquen Ramalina celastri frente a proliferação decélulas HeLa e do Sarcoma 180.
O polissacarídeo da goma de Anacardium occidentale (P JU), com massa molecular de 1,1 x 105, apresenta uma cadeia principal formada por unidades de D-Galp
unidas por ligações glicosídicas β-(1→3), substituídos em O-6. Foi relatada a presença
de quatro substituintes distintos, a saber: a) β-D-GlcpA-(1→6)-β-D-Galp-(1→6)-β-D-
Galp-(1→6)- ; b) α-D-Galp-(1→6)-D-Galp; c) α-L-Araf-(1→6)-D-Galp; e d) α-L-Rhap-
(1→4)-β-D-GlcpA (Menestrina et al., 1998).
O P JU tem apresentado atividade antitumoral in vitro quando testado em células HeLa (Stevan et al., 2000). Também foi testado in vivo contra o Sarcoma 180, obtendo-se inibição do crescimento tumoral na ordem de 39,6% e 55,1%, utilizando-se umaúnica aplicação i.p., nas doses de 100mg.kg-1 e 200 mg.kg-1, respectivamente(Menestrina et al., 1996). Este polissacarídeo, em sua forma livre e encapsulada emlipossomas, também tem-se mostrado eficaz frente à infecção experimental peloSchistosoma mansoni, causando redução do número de vermes e ovos eliminados nasfezes (Gadelha et al., 2001).
Resultados preliminares demonstraram que uma emulsão deste polissacarídeo nativo foi bastante eficaz na reabilitação de lesões cutâneas em camundongos,acelerando o fechamento destas lesões, comparando-se com o padrão normal decicatrização do animal (12 e 17 dias, respectivamente). Do ponto de vistahistopatológico, observou-se uma reepitelização completa da lesão no grupo tratado, no12° dia de evolução, sem que o mesmo fosse observado nas lesões do grupo controle(Rocha et al., 2001). Estes resultados estão de acordo com os relatos de Su et al. (1997)e Carvalho (2000), os quais testaram atividade da quitina de origem microbiológica.
Os lipossomas podem ser definidos como vesículas formadas por bicamadas concêntricas, geralmente constituídas por fosfolipídeos, que possuem umcompartimento aquoso interno, permitindo a incorporação de fármacos hidrofílicos emseu interior ou, alternativamente, a adsorção de fármacos lipofílicos entre suasbicamadas de fosfolipídeos (Lasic & Martin, 1989; Blume & Cevc, 1993).
Os lipossomas podem ser classificados em três grupos, de acordo com seu tamanho e o número de camadas lipídicas constituintes (Pusieux, 1983): a) Vesículas
grandes multilamelares (MLV), formadas por camadas lipídicas intercaladas por
compartimentos aquosos e apresentando diâmetro entre 400 e 3500 nm; b) Vesículas
grandes unilamelares (LUV), constituídas por uma única bicamada que encerra uma
grande cavidade aquosa e diâmetro entre 200 e 100 nm; c) Vesículas pequenas
unilamelares (SUV), que são os menores lipossomas, formados por uma única
bicamada, possuem um pequeno compartimento aquoso e um diâmetro entre 20 e 50
nm.
Usualmente, os lipossomas são compostos por fosfolipídeos, fosfoglicerídeos e esfingolipídeos, bem como por seus produtos de hidrólise, sendo mais comum autilização de colesterol, fosfatidilcolina e fosfolipídeos carregados negativa oupositivamente, o que se reflete no efeito biológico desejado (Katahira et al., 1999;Coderch et al., 2000; Perez-Cullell et al., 2000; Barry, 2001; Betz et al., 2001; Ogiso etal., 2001).
Suas mais importantes aplicações são nas áreas de farmacologia, medicina e biotecnologia, onde servem como veículo para controlar a administração de fármacosencapsulados, material genético, enzimas e outras (macro)moléculas, possuindo tambémutilidade nas indústrias alimentícia e cosmética, tornando possível transformarmoléculas não hidrossolúveis em formulações aquosas contendo lipossomas. No campodas aplicações farmacêuticas vários produtos encontram-se sob investigação, incluindoimunomoduladores, agentes diagnósticos e terapêuticos para o câncer, antibióticos edrogas antifúngicas, entre outros (Lasic, 1992; Killion & Fidler, 1998; El Maghraby etal., 2000; Son et al., 2000; Agarwal et al., 2001; Harrington et al., 2001; Wong & Toth,2001).
As vantagens da encapsulação de fármacos em lipossomas podem ser classificadas em cinco categorias: a) solubilização do fármaco; b) liberação controlada; c) fuga de
determinados sítios; d) captura pelo sistema retículo-endotelial e e) vetorização a sítios
específicos (Lasic, 1992).
A administração tópica de preparações lipossomais, ou seja, a liberação de agentes ativos para a pele a partir de lipossomas utilizados como carreadores tem sidoinvestigada para a terapia dermatológica, cujo objetivo é direcionar o princípio ativopara o local exato da lesão (Honzak & Sentjure, 2000; Patel et al., 2000; Yarosh, 2001;Barry, 2001; Baschong et al., 2001). Uma das vantagens da utilização da forma tópicalipossomal é a droga permanecer concentrada em seu sítio de ação, ou seja, na epidermee derme (Yarosh, 2001).
O termo ferida é usado para descrever uma interrupção da estrutura anatômica e funcional normais, a qual resulta de um processo patológico iniciado interna ouexternamente (Calvin, 1998).
A cicatrização das feridas segue uma resposta complexa e organizada após uma lesão tecidual (Spence e Wong, 1997), e trata-se de uma série de eventos biológicos quecomeçam com coagulação e remodelação dos tecidos (Calvin, 1998; Hunt e Hopf, 1997;Robson, 1997; Steed, 1997). Cada fase da cicatrização apresenta alterações locais esistêmicas, sem a qual o processo pode não evoluir (Araújo et al., 1998).
Na evolução do processo cicatricial podem ser observadas, em seqüência, as seguintes fases: a) Inflamatória; b) Fibroplasia; e, c) Maturação e contração da cicatriz
(Cotran et al., 1994).
O evento inicial no sítio de uma lesão é a hemorragia e a formação de um revestimento rico em fibrina. A fibronectina promove uma estabilização mecânicaprovisória da lesão. A desidratação da camada de sangue na sua superfície, resulta naformação de uma crosta, a qual veda efetivamente a lesão para o ambiente (Wright etal., 1992; Cotran et al., 1994).
Em geral, o processo inflamatório depende da liberação de agentes vasoativos e quimiotáxicos que se difundem do sítio inicial para os vasos sangüíneos. Avasodilatação local aumenta o fluxo sangüíneo da região afetada e, junto com o aumentona permeabilidade microvascular, resultam em perda de fluidos e proteínas do plasma(exsudação) para o tecido. Concomitantemente, mediadores quimiotáxicos estimulam aaderência de células circulantes ao endotélio vascular e promovem sua migração para osítio da inflamação. No sítio do foco inflamatório, tais células recrutadas se acumulam ese tornam ativadas. Em seguida, os macrófagos tomam lugar e removem a fibrinaremanescente, a matriz extracelular danificada e os restos celulares. Os produtos dedegradação das células lesadas, a fibronectina e as enzimas lisossomais liberadas pelosneutrófilos, agem como estímulos quimiotáxicos para os macrófagos (Wright et al.,1992).
A resposta epidermal à lesão é iniciada rapidamente, observando-se células epidermais inserindo-se entre a crosta e o tecido colágeno viável localizado abaixo,formando-se, em poucos dias, o revestimento por células epidermais. A formação dotecido de granulação, que caracteriza a fase inflamatória inicia-se quase ao mesmotempo da formação de fibroblastos e o processo de neovascularização. Os fibroblastosiniciam a manufatura e secreção dos componentes da matriz extracelular(principalmente glicosaminoglicanos e colágeno tipos I e III) e o processo deneovascularização continua. A remodelação do tecido de granulação envolve adegradação de diversos componentes da matriz extracelular por proteinases secretadaspelas células endoteliais. Assim, a espessura completa da epiderme é restaurada semreformar as linhas de conexão, e grande parte do colágeno tipo 3 que foi depositado étrocado por fibras de colágeno tipo I, orientadas paralelamente às linhas do estressemecânico (Cotran et al., 1994).
A transição entre o tecido de granulação produzido na fase inflamatória e a total reabilitação tecidual é um processo lento e gradual composto por desvascularização
progressiva, reabsorção do edema, remodelação do colágeno, e estabilização das
moléculas de colágeno em fibras de colágeno. A finalização do processo inflamatório
ocorre com a resolução do processo de reabilitação. A reabilitação compreende vários
processos incluindo fibrose e uma restituição parcial ou completa da estrutura e função
orgânica. A inflamação está invariavelmente associada com a reabilitação tecidual,
entretanto, os dois processos são, geralmente, considerados separadamente. E, pode-se
considerar a reabilitação a partir de dois fenômenos: a) Regeneração, que consiste na
recomposição completa, a nível de estrutura e função da área lesada; e b) Reparo (ou
cicatrização), o qual envolve a síntese de tecido conjuntivo e sua maturação (Wright et
al., 1992; Cotran et al., 1994).
As feridas abertas sofrem influências externas que prolongam o processo de cicatrização e resultam num processo inflamatório mais evidente, ressaltando-se apresença de edema e fibrose, quando comparadas com feridas cicatrizadasprimariamente (Spence & Wong, 1997). Nessas feridas, a proliferação epitelial ocorrede forma mais lenta, quando a formação do tecido de granulação é mais nítida eacompanhada pela contração da ferida, tendo como resultado final a regeneração doepitélio e formação de tecido cicatricial (Calvin, 1998). Em vista disso, vários estudostêm sido realizados no sentido de reduzir os fatores que dificultam o processo decicatrização (Araújo et al., 1998).
2.0 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar o efeito do tratamento tópico com o polissacarídeo de Anacardium occidentale encapsulado em lipossomas na evolução da cicatrização de lesões cutâneas
experimentais.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
2.2.1 Modificar quimicamente, por sulfatação, a estrutura do polissacarídeo de A.
occidentale (P JU);
2.2.2 Encapsular o P JU em lipossomas;
2.2.3 Formular géis e emulsões contendo o P JU encapsulado em lipossomas;
2.2.4 Avaliar a atividade cicatrizante das formulações obtidas em lesões cutâneas
experimentais.
3.0 RELEVÂNCIA DO TRABALHO
A pesquisa de princípios ativos e sua utilização em sistemas biológicos de vasta aplicabilidade em Medicina Humana e Veterinária reveste-se de significativaimportância pela possibilidade terapêutica a baixos custos, utilizando matéria-primaoriginada da flora regional. O acesso à matéria-prima para elaboração deste princípioativo (P JU) é favorecido pelo amplo cultivo do cajueiro, no Nordeste (400.000-450.000ha), considerando ainda que cada árvore produz 178 a 2000 g/ano de goma, com umvalor médio de 700 g/ano. A atividade extrativa do exsudato é favorecida em árvorescom idade superior a 25 anos, pois aumenta a produção de castanha. Além do mais,trata-se de um recurso natural, renovável, que pode ser explorado sem agressõesambientais.
Resultados prévios sugerem a eficácia deste princípio ativo frente ao crescimento do Sarcoma 180 (Menestrina et al., 1996) e proliferação de células HeLa(Stevan et al., 2000), assim como à evolução da infecção pelo Schistosoma mansoni(Gadelha et al., 2001) e reabilitação de lesões cutâneas (Rocha et al., 2001).
4.0 LOCAL DE EXECUÇÃO, EQUIPE DE COLABORADORES E DURAÇÃO
PREVISTA

Este trabalho será desenvolvido no período de março de 2002 a dezembro de 2005, nos seguintes laboratórios:- Bioquímica, do Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA), UFPE (Profa - Tecnologia de Produtos Bioativos, Dep. Morfologia e Fisiologia Animal, UFRPE (Profa Dra Ana Maria dos Anjos Carneiro Leão); - Hospital Veterinário, Dep. Medicina Veterinária, UFRPE (Profa Dra Maria Cristina - Dep. Patologia, UFPE (Profa Dra Sílvia Limongi Lopes);- Laboratório de Química de Carboidratos, Dep. Bioquímica, UFPR (Prof. Dr.
5.0 MATERIAIS E MÉTODOS
5.1 EXTRAÇÃO, SULFATAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DO
POLISSACARÍDEO DE A. occidentale
O P JU será extraído e purificado de acordo com Menestrina et al. (1998), e sulfatado segundo O’Neill (1955). O produto final será analisado por cromatografiagasosa associada a espectrometria de massa (GC-MS), ressonância magnética nuclearde Carbono-13 (13C-RMN) e cromatografia de gel permeação (GPC), associada aviscosimetria e espalhamento de luz e quanto ao grau de substituição, segundo Francis(1953).
Os lipossomas serão formulados por redispersão dos lipídeos de pró-lipossomas (gel pró-lipoH) em água. Inicialmente o pró-lipoH será dispersado em água àtemperatura aproximada de 65°C. Em seguida, o polissacarídeo de Anacardiumoccidentale, previamente solubilizado em água, será incorporado aos lipossomas.
Diferentes concentrações serão testadas para otimização da concentração máxima depolissacarídeo a ser incorporada.
5.3 FORMULAÇÃO DE GÉIS E EMULSÕES
5.3.1 Preparação de gel hidroalcoólico
Para elaboração desta formulação, inicialmente será realizada a dispersão de natrosol em água aquecida, sob velocidade de agitação de 800-1500 rpm durante 20minutos, neutralizando-se o produto com trietanolamina. Em seguida, serão adicionadosos conservantes nipagin e nipazol previamente solubilizados em álcool etílico. Avelocidade de agitação será, então, reduzida para 100 rpm e mantida por 15 minutospara a obtenção do gel.
5.3.2 Preparação de emulsões
As emulsões serão preparadas a partir do método clássico de inversão de fases (Becher, 1965), variando a natureza e concentração dos constituintes (polavax, lanette,cetiol, parafina liquida, propilenoglicol, nipagin e nipazol).
5.4 INCORPORAÇÃO DOS LIPOSSOMAS NO VEÍCULO Após seleção das formas mais estáveis de emulsão e gel hidroalcoólico, será realizada a incorporação dos lipossomas nestas formulações, por agitação manual.
Diferentes formulações serão criadas fazendo-se variar a razão entre a concentração delipossomas e emulsão ou lipossomas e gel hidroalcoólico, a fim de se obter umaformulação de viscosidade ideal e maior estabilidade a longo prazo.
5.5 CARACTERIZAÇÃO DOS LIPOSSOMAS CONTENDO O POLISSACARÍDEO
DE A. occidentale
5.5.1 Estudo de Estabilidade das Formulações
Os testes de estabilidade acelerada e a longo prazo têm a finalidade de estimar o comportamento físico-químico das formulações de lipossomas contendo polissacarídeoincorporados em gel ou emulsão, durante o armazenamento em tempo real paracomercialização.
Na primeira etapa, as formulações serão submetidas ao envelhecimento acelerado: resistência à centrifugação, resistência às vibrações e aos ciclos sucessivos decongelamento e descongelamento. As formulações que apresentarem maior estabilidadefrente aos testes serão selecionadas e submetidas ao envelhecimento em longo prazo.
A estabilidade acelerada tem como objetivo submeter as formulações às condições de estresse que simulem transporte e armazenamento. O teste decentrifugação simula a passagem acelerada do tempo e consiste em submeter asformulações à rotação em centrífuga; os movimentos de transporte são simulados pelasvibrações (150 strokes/min) em banho-maria com temperatura de aproximadamente40°C durante uma semana; o ciclo congelamento-descongelamento, por sua vez, avaliaa resistência das formulações a mudanças drásticas de temperatura e consiste emcongelá-las por 16 horas a -18°C e descongelá-las durante 8 horas a 25°C, podendo-sevariar as temperaturas em mais ou menos 2°C.
A estabilidade a longo prazo tem como objetivo estabelecer a durabilidade das formulações. Neste teste, as formulações serão observadas quanto a mudanças em seuaspecto geral, forma e homogeneidade das partículas, presença de bolhas de ar e cristais,bem como variações de pH e viscosidade (determinadas em potenciômetro eviscosímetro respectivamente), conteúdo do polissacarídeo de Anacardium occidentale,tipo de emulsão (O/A ou A/O), espalmabilidade e condutividade. Estes parâmetrosserão determinados dias após a fabricação e em intervalos de tempo regulares (7, 15, 30,60, 90 dias, 6, 12, 18 e 24 meses).
5.5.2 Taxa de encapsulação do P JU nos lipossomas
A taxa de encapsulação do P JU será determinada através de ultracentrifugação dos lipossomas a 44.000 rpm, a 4oC, durante 1 hora. Posteriormente, o sobrenadanteserá dosado pelo método de fenol-sulfúrico (Dubois, 1956), utilizando-se uma curvapadrão de D-glucose, variando entre as concentrações de 8 a 80 µg. Para o cálculo dataxa de encapsulação será utilizada a seguinte fórmula: (TE - Taxa de encapsulação; P JUT - Quantidade de polissacarídeo de A. occidentaletotal;P JUS - Quantidade de polissacarídeo de A. occidentale no sobrenadante).
5.6 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CICATRIZANTE DAS FORMULAÇÕESCONTENDO POLISSACARÍDEO DE A. occidentale5.6.1 Animais Serão utilizados 30 cães (Canis familiaris), adultos, sem raça definida, com peso variando entre 9 e 13 kg, provenientes do Canil de Sanidade Animal da Cidade doRecife e considerados clinicamente sadios após exame clínico sistemático. Todos osanimais serão submetidos à avaliação hematológica e parasitológica. Serão utilizadosapenas animais sem alterações dermatológicas.
Durante toda a fase experimental os cães serão mantidos em canis coletivos, no Hospital Veterinário da UFRPE, em número de três, permanecendo na parte coberta ousolário, de acordo com vontade própria, e recebendo cuidados padronizados de higiene.
A alimentação constará de ração específica para cães e água à vontade, sendo mantidosdurante 15 dias para observação da higidez orgânica e adaptação às novas condições dealimentação e manejo.
5.6.2 Protocolo experimental5.6.2.1 Grupos experimentais Para o delineamento experimental, os animais serão divididos, aleatoriamente, em três grupos contendo dez cães cada. A variação entre os grupos constará do tempode pós-operatório requerido para avaliação dos parâmetros macroscópicos e realizaçãoda biópsia de pele (avaliação histopatológica).
Os cães do grupo "A" permanecerão em observação durante sete dias, sendo a seguir realizada biópsia das quatro falhas cutâneas; o grupo '"B" permanecerá por 14dias e os animais do grupo "C" durante 28 dias sendo, a seguir, submetidos à biópsiacutânea das feridas.
Após jejum hídrico e alimentar de doze horas, os cães serão encaminhados à área de cirurgia, pesados e pré-anestesiados com sulfato de atropina na dose de 0,044mg.kg-1, via subcutânea, recebendo 15 minutos após a associação de acepromazinana dose de 0,2mg.kg-1 e cloridrato de ketamina 15 mg.kg-1, via intramuscular comoanestesia. Todos os animais serão mantidos em venóclise com administração de cloretode sódio 0,9% (p/v) .
Com o cão posicionado em decúbito ventral, a antissepsia do campo operatório será feita com polivinil-pirrolidona-iodo1 seguida de álcool etílico a 70° eclohrohexidina. Os panos de campo serão posicionados de forma rotineira e com auxíliode moldes adesivos de papel de 2,5cm2, previamente confeccionados e esterilizados emautoclave, quatro áreas serão demarcadas na região torácica, duas de cada lado do tóraxe distantes 10cm entre si. A pele será incidida com lâmina de bisturi e divulsionada datela subcutânea com tesoura romba até sua ressecção, produzindo uma falha cutânea de6,25cm2. A hemostasia da área será realizada por compressão digital.
Cada falha receberá o tratamento de acordo com a metodologia estabelecida preenchendo toda área cruenta sem ultrapassar as margens da ferida e a pele,considerando-se a ferida controle a situada caudalmente ao tórax na região esquerdarecebendo aplicação tópica da formulação sem polissacarídeo e recoberta com gaze.
Cranialmente, nessa mesma região, será aplicada sobre a falha produzida gel com polissacarídeo. No lado oposto do tórax, a ferida caudal receberá a pomadareferência, e a cranial, solução de polissacarídeo preparada em cloreto de sódio 0,9%(p/v). Os medicamentos esterilizados serão mantidos no interior de suas embalagens eabertos apenas no momento de sua aplicação.
O tórax será envolvido com atadura de crepom seguido de proteção com curativo em malha utilizando-se também, colar elizabetano durante todo o períodoexperimental.As trocas da faixa de crepom e curativo em malha serão realizadasdiariamente.
5.6.2.3 Avaliação pós-operatória5.6.2.3.1 Avaliações clínicas As avaliações clínicas serão iniciadas 24 horas após a cirurgia e repetidas diariamente até o momento da biópsia, observando-se o estado geral do animal, apetite,temperatura corporal e os parâmetros fisiológicos.
5.6.2.3.2 Avaliação macroscópica da lesão As feridas serão avaliadas com 48 horas de pós-operatório, observando-se a presença de hiperemia ao redor da falha cutânea ou em torno do curativo, edema, dor,seroma, hematoma, secreção, odor, prurido, presença e características das crostas,coloração e aspecto do tecido de granulação, contração da ferida, aderência doscurativos e tecido cicatricial.
Todas as feridas serão avaliadas, fotografadas e medidas as suas bordas empregando-se régua milímetrada (paquímetro) no To (momentos antes da biópsia), enos dias 7, 14 e 28 do pós-operatório.
5.6.2.3.3 Avaliação microbiológica Amostras serão colhidas através "swabs" da lesão, no To, no 7º, 14º e 28º dias de tratamento. O material será semeado em placas de Petri contendo ágar sangue e ágarlevine e incubado em estufa bacteriológica à 37ºC durante 24 horas. As bactérias serãoclassificadas através dos aspectos morfológicos de colônias e morfotintoriais ao Gram,assim como serão utilizadas provas bioquímicas de acordo com Carter (1988).
A presença de secreção nas feridas determinará a coleta imediata do material para realização de cultura e identificação do microorganismo.
5.6.2.3.4 Avaliação da contração da ferida. Para o cálculo da área das feridas, será realizada a medição de suas bordas no momento da biópsia, observando-se o maior e menor diâmetro. A partir desseselementos, a área será calculada, utilizando-se a equação matemática recomendada porPrata et al. (1988), onde "A" representa a área, "R" o raio maior e "r" o raio menor dalesão.
O cálculo do grau de contração será expresso em percentual assim como o índice de cicatrização utilizando-se as equações matemáticas propostas por Ramsey et al.,(1993), onde Wo = área inicial da ferida; Wi = área da ferida no dia da biópsia (7,14 e21 dias) e Ui = área do tecido de granulação.
5.6.2.3.5 Avaliação histopatológica As biópsias cutâneas serão realizadas de acordo com o tempo de pós-operatório determinado previamente para cada grupo. Os animais retornarão ao bloco cirúrgicoapós jejum hídrico e alimentar de 12 horas e serão submetidos as condutas idênticas dopré-operatório anterior para retirada do fragmento de pele total e área da ferida,abrangendo um centímetro além de cada margem dorsal e ventral no sentido caudal,aprofundando-se até o plano muscular. Imediatamente após, a pele e a tela subcutâneaserão fixados em formaldeído 4% (v/v), processados rotineiramente e corados com HE ePicroSirius (Michalany, 1991; Coelho, 1998).
Os resultados obtidos serão expressos como média ± desvio padrão (M ± dp), submetidos à análise de variância e ao teste de Tukey, considerando-se estatisticamentesignificativos os valores comparados ao nível de significância de p ≤ 0,05 (Arango,2001).
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